中國倉鼠卵巢（CHO）細胞作為重組蛋白生產(chǎn)的重要宿主細胞之一，隨著細胞系開發(fā)和培養(yǎng)工藝的優(yōu)化，其生產(chǎn)水平已大幅提高。但一直以來，我們對于細胞內(nèi)重組蛋白生產(chǎn)的分泌機制知之甚少。特別是隨著新一代生物制劑的開發(fā)，復(fù)雜而難以表達的（DTE，difficult-to-express）重組蛋白數(shù)量也大大增加了。為了提高各種重組蛋白的生產(chǎn)，有必要了解蛋白分泌途徑中可能的限速步驟。

結(jié)合本公司瞬轉(zhuǎn)制備業(yè)務(wù)平臺大量的抗體、融合蛋白、抗原蛋白的制備實踐經(jīng)驗，本文探討CHO細胞分泌途徑中導(dǎo)致重組蛋白低效分泌和聚集的瓶頸，和當(dāng)前所使用的解決策略。

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CHO細胞內(nèi)重組蛋白的分泌途徑

CHO細胞內(nèi)，重組蛋白的分泌起始于多肽向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)移。新合成的肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)后，進行折疊和成熟，然后通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽，運輸?shù)礁郀柣w上，進行聚糖延伸或磷酸化修飾等，最后分泌到胞外（圖1）。嚴格的質(zhì)量控制機制，包括未折疊蛋白反應(yīng)（UPR，unfolded protein response）和ER相關(guān)的蛋白降解（ERAD，ER-associated-protein-degradation）負責(zé)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的蛋白穩(wěn)態(tài)。

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重組蛋白分泌途徑中的潛在瓶頸

細胞內(nèi)蛋白的分泌途徑，每一步都受到嚴格的調(diào)控，以保證蛋白的正確加工和分泌。但當(dāng)目標分子的轉(zhuǎn)錄或者翻譯水平過高時，質(zhì)量控制機制可能會不堪重負，導(dǎo)致蛋白分泌受阻。此外，與內(nèi)源性蛋白相比，重組蛋白特別是非天然結(jié)構(gòu)蛋白可能更為復(fù)雜，它在細胞內(nèi)的正確折疊加工也更具有挑戰(zhàn)性。

重組蛋白在分泌途徑的潛在瓶頸包括新生肽鏈進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的效率低下，信號肽的錯誤切割，未正確折疊導(dǎo)致的降解或細胞內(nèi)聚集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡和低效的膜泡運輸。多項研究報告了影響重組蛋白分泌導(dǎo)致蛋白聚集的因素。比如，有研究人員發(fā)現(xiàn)，在多肽轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程中，信號識別顆粒（SRP）復(fù)合物會造成信號肽的錯誤切割，從而導(dǎo)致輕鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，表達量低。由于與輕鏈的組裝效率低，導(dǎo)致細胞內(nèi)重鏈聚集的現(xiàn)象也有所報道。而重組蛋白的胞內(nèi)累積和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白（ER stress-induced proteins）水平的升高，可能暗示細胞折疊和分泌能力不足。

對這些由于分泌途徑限制導(dǎo)致的表達量低和蛋白聚集問題，可以通過細胞工程和培養(yǎng)工藝的優(yōu)化，提高重組蛋白表達，減少蛋白聚集。

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解決分泌途徑瓶頸的方法

3.1 基因工程

利用基因工程改善分泌途徑，一是通過設(shè)計表達載體；二是調(diào)控參與目標蛋白從胞漿中的未成熟蛋白（翻譯后）轉(zhuǎn)變?yōu)樽罱K形式的成熟蛋白的核心分泌機制基因的表達。現(xiàn)階段的研究主要包括新生多肽向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)移、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的蛋白折疊和膜泡運輸部分。

新生肽鏈向分泌通路的轉(zhuǎn)移由信號肽引導(dǎo)。信號肽與胞質(zhì)內(nèi)的信號識別顆粒（SRP，signalrecognition particle）相互結(jié)合并識別，引導(dǎo)多肽鏈到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，穿過易位子（Translocon）形成的通道進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，隨即信號肽被信號肽酶水解。對于不同的目的蛋白，選擇合適的信號肽，對改善多肽的轉(zhuǎn)移、提高表達量和阻止肽鏈的錯誤剪切有著非常重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，通過與SRP和易位子亞基共表達，可以促進某些難以表達（DTE，difficult-to-express）蛋白的正確加工，提高表達減少蛋白聚集。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)合成加工場所。多肽進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)有大量可溶性的駐留分子伴侶和折疊酶，如蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI，protein disulphide isomerase）、BIP、鈣聯(lián)蛋白等，輔助和監(jiān)控多肽的正確折疊和裝配。在某些情況下，比如信號肽剪切錯誤時，蛋白質(zhì)的折疊受到影響，導(dǎo)致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，由此引發(fā)一系列分子伴侶和折疊酶表達上調(diào)為標志的應(yīng)答反應(yīng)，稱為未折疊蛋白反應(yīng)（UPR，unfolded protein response）。這種現(xiàn)象被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER Stress）。細胞內(nèi)UPR信號通路的調(diào)節(jié)元件有XBP-1，ATF4，ATF6等，在發(fā)生UPR時，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子和折疊酶表達，提高細胞處理未折疊蛋白的能力。值得注意的是，如果高水平的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件持續(xù)存在，最終會導(dǎo)致細胞的凋亡。

目前為止，有許多研究者針對這些參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白加工的基因進行了一系列實驗，以評估其對細胞分泌的影響。多數(shù)研究表明這些基因的調(diào)控對重組蛋白的生產(chǎn)具有積極作用，但一些研究則報道了相反的觀察結(jié)果（見表1）。還有研究者將目光轉(zhuǎn)向了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶保留機制?？扇苄詢?nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶在細胞器中的定位是由C端KDEL基序介導(dǎo)的，該基序被KDEL受體識別。KDEL受體（KDELR，KDEL receptor）是一個七層跨膜蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和順式高爾基體之間循環(huán)，以pH依賴性方式從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后腔室捕獲錯誤分選的分子伴侶。研究表明，在CHO細胞過表達KDELR1，可以提高特別是生產(chǎn)后期的重組蛋白表達。

蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊組裝后，通過膜泡運輸?shù)礁郀柣w上，經(jīng)過進一步加工形成成熟蛋白，再經(jīng)過高爾基體小泡運輸分泌到胞外。膜泡運輸是真核細胞內(nèi)蛋白在內(nèi)膜系統(tǒng)各細胞器轉(zhuǎn)運的主要方式，主要包括運輸囊泡的出芽、轉(zhuǎn)運、拴留、錨定和膜融合過程。整個過程受到許多因子的調(diào)控，如Coat、SM、Tether、SNARE和Rab蛋白等。已有研究表明，無論是過表達促進膜泡運輸?shù)幕蚧蚯贸撜{(diào)控膜泡運輸?shù)幕?，對重組蛋白的表達都顯示了積極影響。

除了上述常用基因工程，最近，microRNA（miRNA）分子也被研究用于改善重組蛋白生產(chǎn)的分泌途徑。miRNA是一類小的非編碼RNA，通常由~22個核苷酸組成，參與mRNA的表達調(diào)控。與傳統(tǒng)的基因工程相比，miRNA的優(yōu)勢在于可以同時靶向調(diào)控多個基因和通路，提高了基因工程的控制范圍。比如，在CHO細胞內(nèi)表達mitosRNA-1987，抗體的表達量提高了~60%，這可能是由于mitosRNA-1987同時下調(diào)了CerS2和Tbc1D20基因的表達。但同時，由于miRNA靶標眾多，在靶向我們希望的目標基因時，也可能調(diào)控了我們不希望被改變的基因表型。因此，鑒定miRNA的結(jié)合靶標并了解其功能，有助于miRNA在細胞基因工程中的應(yīng)用。

3.2 培養(yǎng)基和工藝優(yōu)化

細胞在生物反應(yīng)器中容易受培養(yǎng)環(huán)境的影響，包括pH，溫度，滲透壓和溶氧濃度。優(yōu)化工藝條件可以有效的提高重組蛋白表達量，緩解蛋白聚集。研究表明，pH和溫度的降低，滲透壓的增加，高溶氧濃度都對表達量和聚集體的減少顯示出積極作用。

此外，還研究了培養(yǎng)基補充劑對提高蛋白表達，緩解聚集的作用。研究表明，改變培養(yǎng)基組成（硫酸銅和半胱氨酸水平）包括小分子化學(xué)伴侶如甘油等可以減少聚集。表明活性劑如吐溫80和海藻糖也可以阻止聚合。此外，將工藝參數(shù)優(yōu)化和培養(yǎng)基/補料補充劑添加相結(jié)合，在提高蛋白表達，減少聚集展示了良好的前景。

最近的蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示了培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)基補充劑對分泌途徑的影響。比如，當(dāng)培養(yǎng)溫度從37℃降到33℃時，多個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留伴侶表達水平差異高達6.7倍。丁酸鈉和丙戊酸通常被認為是脫乙酰化酶抑制劑，促進有效轉(zhuǎn)錄，提高蛋白表達。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，它們還可以正調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留伴侶和UPR信號通路元件。

在實際應(yīng)用中，還可以將基因工程和工藝工程系統(tǒng)地聯(lián)合起來，以進一步提高重組蛋白生產(chǎn)。例如，在DTE Fc融合蛋白，Sp35Fc的瞬時表達中，以適當(dāng)比例共轉(zhuǎn)染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留伴侶CypB，并在轉(zhuǎn)染后加入0.5mM PBA和1%(v/v)的甘油，可以在12天的培養(yǎng)中使細胞表達量顯著提高6倍，并且無二硫鍵結(jié)合的蛋白聚集。

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其他

目前解決重組蛋白分泌和聚集的方法仍然基于反復(fù)不斷的實驗探索。更全面的了解CHO細胞中復(fù)雜的分泌和折疊途徑，將有助于指出合理優(yōu)化的方向。測序技術(shù)和多組學(xué)工作的最新進展使我們能夠全面系統(tǒng)的了解細胞機制及其與細胞系和細胞培養(yǎng)工藝的聯(lián)系。一些研究已經(jīng)將組學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)用于培養(yǎng)基組成或基因工程，以此進行細胞系性能優(yōu)化。另一方面，基因編輯工具的進步，也為分泌途徑中潛在細胞靶點的驗證提供了強大的技術(shù)支持。

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